水仙分球繁殖的频率较低,每个母鳞茎一年只能分化产生3~4个小鳞茎。
另外,近年来由于病*病的感染退化严重,鳞茎逐年变小,花也变少,而采用组织培养的方法则能迅速批量地提供作种子用的小鳞茎。组织培养即通过无菌操作,将离体的材料接种在人工培养基上。使其通过分化和再分化形成新的植物体。组织培养快速繁殖具备很多优点,如速度快,可以去除病*,遗传性稳定,便于种质保存等。
由于组织培养倍要较高的技术力量和较多的设备投资,目前主要是科研部门在植株脱*与新品种繁育时采用。生产性的繁殖由于成本较高不予采用。水仙花进行脱*苗培育时,由于许多的水仙品种不能结出有活力的种子,无法用种子培育出无病*的实生苗,因此,消除原种的病*最有效的办法是对水仙的顶端分生组织进行培养。至于水仙新品种的推广,需要大量的原种,只有组织培养可以达到较高的繁殖率,从而提供大量的原种。
水仙的组织培养与其他的植物的组织培养大同小异,下面分步讨论。
一、培养基的配制
一般用MS培养基进行增减,pH用氢氧化钠调到5.6,然后在l20℃的高压锅下灭菌20分钟,取出备用。
基本培养基的配制是用MS培养基+2%的蔗糖;芽诱导培养基的配制是用MS培养基+1毫克/升萘乙酸+5毫克/升6-苄基腺嘌呤;根诱导培养基的配制是用MS培养基+1毫克/升乙酸。
二、培养基的制作
是组织培养的关键步骤之一。培养基不仅对外植体具有支撑作用,而且外植体要从中吸取必要的营养物和水分。其成分包括大量元素、微量元素、植物激素类、有机物(维生素B1、维生素B、肌醇、甘氨酸、烟酸等)、蔗糖和琼脂等。
母液配制:为取用方便和提高各种元素的精确度,经常把化学试剂事先制成母液。一般配制成大量元素、微量元素、维生素、铁盐和植物激素等几种母液。下而以MS培养基为例予以说明。
1.大量元素母植(母液1)
一般配成10倍的母液,如MS培养基中硝酸钾的用量为每升毫克,在配制大量元素母液时称取0毫克,其它大量元素以此类推。配制培养基时,再按比例计算出母液的取用量。
配制大量元素母液时,应注意各种试剂的加入顺序,如Ca2+和PO2-相遇易发生沉淀,一般先将其它试剂溶解混合,加水稀释后再注入氯化钙溶液,最后定容至毫升。
2.微量元素母液一般配制成倍母液,如MS培养基中硫酸锰的用量为每升毫克,在配制微量元素母液时称取0毫克,其它微量元素以此类推。
3.维生素母液(母液3)维生素母液有两种配制方法:将各种维生素配成混合的倍母液;或将各种维生素分别配成取用方便的浓度。
4.铁盐母液
通常使用的铁盐为FeSO。·7H20,由于在使用过程中容易产生Fe(OH)3沉淀,一般先将其配成鳌合物。
5.植物激素的配制
植物激素用量较低,一般配制成0.1~0.5毫克/毫升的母液。植物激素多难溶于水,常采用酸、碱和酒精为溶剂。
IAA:先溶于少量95%的酒精,再加水定容。
NAA:先溶于少量95%的酒精或加热溶解,再加水定容。
2,4-D:先溶于1摩尔/升的HC1溶液,再加水定容。
KT,BA:先容于1摩尔升的HCl溶液,再加水定容。配制好的母液要在2~4℃的冰精中保存,每次使用前应检查有无沉淀或微生物污染,若已变质应重新配制。
培养基的制作过程是:将琼脂熔化后,加入所需要的各种元素和蔗糖,充分搅拌后将pH调至5.4~5.8,分装至培养瓶中,高压灭菌后备用。
三、外植体的制备
顶端分生组织外植体的制备:在每年的9~10月份,选出外表无病、健壮饱满的水仙鳞茎,在4~10℃的条件下预处理4~10周,去掉干枯鳞茎片及干枯部分的鳞茎盘,用肥皂洗净,再用自来水冲洗干净,放人饱和漂白粉上清液中15~20分钟,或者用0.1%升汞浸泡10分钟进行消*,然后用无菌水冲洗3~4次,再按以下方法切割:
(1)把鳞片切掉2/3以上,留下鳞片基部及鳞茎盘,再纵切成1.5~3毫米宽的切块。
(2)把鳞茎盘切去,取鳞片切成上、中、下三部分,并将内、中、外部鳞片分开,再把各部分鳞片切成长2~4毫米、宽1.5~3毫米的切块。
(3)将鳞茎盘切成长2~4毫米、宽1.5~3毫米的切块。把以上切块分别接种于不同附加物的MS,N。等培养基中,pH5.4~5.8,置于温度23~25℃、弱光照下培养。
水仙可以培养的部位很多,除鳞茎外,还有花茎、子房和叶片等,以鳞茎为外植体,培养中感染的机会较多,而以花茎、子房和叶片等为外植体则污染较少。从遗传稳定性的角度讲,带有茎盘的鳞片外植体,易于诱导不定芽生长,故变异的可能性较小;而以其它部位为外植体,皆要经过分化产生愈伤组织,然后再分化产生芽,因此变异的可能性较大。
不同部位组织产生小鳞茎的能力差异很大。通常以具有鳞茎盘的鳞片产生小鳞茎最快、最多,一般接种15天就可见有小突起出现,随培养时间的延长,小鳞茎逐渐形成,并不渐增加,每块外植体最多可达17个。其它部位的培养效果见表4-3,从表4-3中可知,除带有鳞茎盘的鳞片之外,花茎产生小鳞茎的数量也较多。一般花茎在培养基上很快便产生出白色的愈伤级织,20天后愈伤组织表层的细胞就逐步产生分生组织细胞,由它们形成小鳞茎,在适宜的条件下,小鳞茎都可以萌发生长成幼苗。
其他组织外植体的制备:在9月,水仙鳞茎内的花芽已经完成,一般从花梗基部至花芽顶端长约0.7厘米,剥去外包鳞片,切去鳞茎盘,用含有1%的活性炭的次氯酸钠溶液消*,无菌水冲洗两次,分切成花梗、子房、花盘和叶片等几部分,再将花梗和子房切成1毫米厚的薄片,花盘切成3毫米×3毫米×3毫米的小方块,叶片不用再分切,可直接培养。
双鳞片外植体的制备:鳞茎选取同上,剥去外层干燥鳞片和根系残留物,并切除鳞茎上部的2/3,剩下的经表面消*以后垂直切割成若干块,再切成带有部分鳞茎盘2~3层鳞片的切块。最后把鳞片修成长10毫米、宽5毫米作为外植体,通常一个成熟的鳞茎可分切为50~60个外植体。
四、“外植体”的低温处理
直接取自田间的鳞茎,如不经低温处理,成活率仅有2%,面在4~10℃下处理6周,诱导率提高到90.9%。贮藏中期(8月19日)的鳞茎,未经低温处理者,诱导率只有6.67%,而低温处理4周,诱导率即可提高到94.1%。将鳞茎在4~10℃下预处理4~9周,接种后组织块保持原有的颜色(鳞茎盘浅*色,鳞片白色),培养3天后组织块开始膨大,颜色逐渐变白,20天左右形成小鳞茎,一个月后形成小苗,诱导率达98%~%。
五、在鳞片组织培养中鳞茎盘的作用不带鳞茎盘的鳞片,诱导率较低。带鳞茎盘的鳞片取得了较好的培养效果,两者相比,前者的成球率为后者的35.5倍。带鳞茎盘的鳞片一般在接种10天后,鳞片基部与茎盘连接处即产生1~4个小突起,20天左右发育成小鳞茎。不带鳞茎盘的鳞片,一般在接种后一个月才在鳞片纵切口上形成小突起,然后发育成小鳞茎,而且较小。不带鳞片的鳞茎盘不能分化。
六、接种和培养
水仙花梗在基本培养基中培养一个月后便产生了少量的不定芽,转移到芽诱导培养基后,不定芽数量显著增加。
叶片培养时,不定芽仅在叶基上形成,新形成的芽结成小鳞茎,有利于提高移植的成活率,在根诱导培养基培养,既可促进鳞茎的形成,也能促进根的形成。
双鳞茎外植体在气温25℃、光照16小时的条件培养下,可以先再生出小鳞茎,在18℃和16小时的光照下继续培养,6~8周内小鳞茎长出两片叶和根系。这样的小苗不需炼苗,小鳞茎的体积越大,移栽的成功率越高。
七、移植与炼苗
在培养基培养分生的小苗,需要进行几次移植,便小苗逐渐适应外界环境。移植时用镊子将小苗从三角瓶或试管中取出,再用蒸馏水将小苗根上的培养基残留物冲洗掉,然后移栽到无菌土或其他介质上。在气温为20℃的室内养护10~20天,以后逐渐增加光照强度,待小苗适应性增强后,才可移栽入小盆,这个适应的过程便称为炼苗。经炼苗后的小苗,可分栽到小盆或苗床上进行日常管理。组织培养在一周期的培养中的繁殖率可达倍以上。
水仙可以无土栽培,无土栽培需要有栽培槽,槽宽厘米以内,深度30~40厘米。为了通气方便,槽底垫石块,槽内放栽培物质,如蛭石、腐熟木屑、珍珠岩等。冬天要设防寒、保暖的覆盖膜。生长期间的营养液元素要全面,大量元素的比例氮:五氧化二磷):氧化钾为1:1:1,微量元素适量。pH值6~7。初栽时,每周施用1~2次,生长旺盛期,每周施用2~3次,平时灌溉清水。5月后停止施肥和供水。5月底选晴天把鳞茎球取出,去掉叶片及须根,并在鳞茎盘处附护根泥,并在日光下晒干、贮藏。